ORCID: 0000-0002-4345-0090

弓形虫病是由刚地弓形虫感染引起的一种呈全球流行的人兽共患原虫病。刚地弓形虫为专性有核细胞内寄生的原虫，对人和动物的危害均较大，免疫力正常的人和动物感染后一般不表现明显的临床症状，但免疫力低下的人和动物感染后，后果比较严重，甚至会引起死亡[1]。目前，临床上用于治疗急性弓形虫病的药物主要是磺胺类药物，但该类药物的副作用比较大，该药只对弓形虫速殖子有抑制效果，对弓形虫包囊无效[1-2]。因此，寻求具有良好抑制弓形虫增殖、且毒副作用小、价廉的抗弓形虫药物一直是各国学者努力的方向。

目前，在筛选抗弓形虫药物方面已做了广泛的研究，某些抗生素[3-4]、除草剂(如氟啶酮、草甘膦)[5-6]、中药(如青蒿素、黄芩)[7-8]、抗癌药物(如紫杉醇)等[9]均被发现具有一定的抗弓形虫效果。以此为基础，结合药物的种类、分子结构、作用机理及弓形虫自身的特点，本研究从除草剂、中药、抗癌药和其他抗寄生虫药中分别筛选了部分药物，利用HFF细胞和表达绿色荧光蛋白的弓形虫RH株(Tg-GFP)作为评价系统[10-11]，试图检测药物的抗弓形虫活性。

1 材料与方法

1.1细胞、弓形虫和小鼠 人包皮成纤维细胞(HFF)为美国 ATCC 公司产品；RH 株弓形虫由本实验室传代保存；稳定发绿色荧光弓形虫虫株(RH-GFP)由日本代广大学国家原虫病研究中心玄学南教授馈赠，本实验室传代保存。SPF 级 BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2试剂和药物 四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品；DMEM培养基和胎牛血清(FBS)为GIBICO产品。

乙胺嘧啶、钙离子载体 a和钙离子载体螯合剂 BAPTA-AM为Sigma公司产品；中药姜黄素(≥98%)和蒿甲醚(≥98%)为成都曼思特生物科技有限公司产品；抗球虫药物妥曲珠利(≥98%)和泊那珠利(≥98%)为湖北远成赛创科技有限公司产品；除草剂草甘膦由西安丰旺达生物科技有限公司生产，阿特拉津为sigma 公司产品；注射用三氮眯、环磷酰胺和吡喹酮片为河北远征药业有限公司产品；磺胺嘧啶钠注射液为北京双鹤药业股份有限公司产品；常山酮为武汉驰飞化工品有限公司产品。

1.3细胞和弓形虫的复苏和培养 按常规方法复苏、培养HFF细胞和弓形虫RH-GFP虫株。

1.4药物的细胞毒性试验 本实验采用MTT的方法[11]。消化对数生长期的HFF细胞，反复吹打制成单个细胞悬液；调整细胞悬液浓度为5×105个/mL，接种96孔细胞培养板，200 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2环境中培养48 h；形成单层细胞后吸弃各孔中的旧培养液，加入含不同浓度药物的新培养液，每孔100 μL，同时设试验对照组(不加药物组)和空白对照组(无细胞组)，每种药物分别设7个浓度(见表1和表2)，每个浓度6个重复。37 ℃、5% CO2中培养96 h，小心用PBS冲1遍后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h；小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD490nm下测量各孔的吸光值。以6个重复孔的平均值表示HFF细胞存活情况，细胞的存活率(%)=(OD实验组-OD未加细胞对照组)/(OD空白对照组-OD未加细胞对照组)×100%。以90%的细胞存活作为药物对细胞的最大安全浓度[11]。

1.5药物对弓形虫增殖的影响 收集并纯化弓形虫RH-GFP速殖子，感染已被 HFF 细胞铺满的96孔培养板，每孔5×103个弓形虫速殖子。在37 ℃、5% CO2条件下培养 2 h，用 PBS 洗2遍，去掉未粘附或未入侵的虫体，再分别加入含有不同药物的培养基(见图1A和图1B)培养24 h，计数每个带虫空泡内虫体的数量。计算方法为：随机选取 10 个视野，计数每个视野内带虫空泡内含1、2、4、8、16 个速殖子的带虫空泡的数量，进而计算平均每个带虫空泡内虫体的数量。筛选对弓形虫增殖有效的药物，并检测弓形虫增殖对药物浓度的依赖性。每孔重复 3 次，每个试验重复3 次。

1.6药物对弓形虫入侵的影响 用含不同种类的药物培养基悬浮RH-GFP速殖子(图2A和图2B)，37 ℃放置20 min；再将虫体悬液加入已被铺满 HFF细胞的96 孔培养板中，每孔含有5×103个。37 ℃、5% CO2条件下培养 2 h，倒掉培养上清，加入PBS 洗2遍，去掉未粘附或未入侵的虫体，继续培养。24 h 后荧光显微镜下观察计数平均每个视野内带虫空泡的数目。计数方法：每孔随机挑取 10 个视野，计数每个视野内带虫空泡的数量，计算其平均数。选择对弓形虫入侵有效的药物，并检测弓形虫入侵对药物浓度的依赖性。每孔重复 3 次，每个试验重复3 次。